​CRISPR-CAS9 技术操作流程sop

CRISPR-CAS9 技术操作流程sop

今天我们简单谈一下CRISPR-CAS9 技术操作流程

1.1靶基因序列的确定

1.打开NCBI：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，查询靶基因的核酸序列（这里以wnt1为例说明），输入wnt1。

2. 找到对应的基因序列，点击,获得的页面找到mRNA sequences区域，选择带NM的编号。

3. 进入页面后，找到CDS区域，点击CCDS，复制基因序列到Word文档中备用，即获得靶基因序列。

1.2 sgRNA序列在线设计

1.打开网页：http://crispr.mit.edu/，在输入框中输入wnt1和邮箱，同时选择unique genomic region (23-500 nt) 选项，再将wnt1基因的序列复制到sequence输入框（注意：只是别同一外显子区域，不能跨区域添加，序列长度不能大于250bp，对于长靶基因序列可分段进行）。

2.获得如下页面，点击红色标记区域即可获得sgRNA设计所需的序列，一般选择分值高于60的序列，复制前6个分值高的所需序列于Excel表中，备用。

3. 向两条链上添加粘性末端如下图，然后将设计好的序列送往公司合成。

CACCgTGCTACGCTGCTGCTGGCGC

AAACCGCGGTCGTCGTCGCATCGTc

1.3两条sgRNA的设计

1.在获得sgRNA设计结果页面点击Nickase analysis。

2.进入页面后，可以获得两条sgRNA对应的分数，选择单个sgRNA分值大于60，quality值为high的两条序列，即为需要的序列，分别将两条序列保存在Excel表中。

3.相同的方法获得反义链及所需要送公司合成的序列。

1.4 sgRNA的构建及鉴定

1. 退火形成粘性末端，反应体系。

2. 载体线性化，这里我们以PX458载体说明，反应体系如下图，将反应体系电泳，切胶回收。

3. DNA连接，将sgRNA和载体连反应，反应体系如图，室温孵化10min。

3. 重组质粒的转化

1. 将感受态细胞解冻，混匀。

2. 加入10μl上述转化后的DNA于50μl的感受态细胞中，混匀，冰上静置30min。

3. 42℃热激90s，迅速放入冰中2-3min。

4. 将将菌液涂于事先备好的LB培养基上，37℃过夜培养。

5. 挑取单克隆，提取质粒，测序。

4. 转染

1. 吸取97μl无血清和抗生素的DMEM培养基到无菌的1.5ml离心管中，加入3μl转染试剂PEI并吹打混匀，室温5min。

2. 向上述混合液中加入1μg质粒DNA混匀，室温放置15min。

3. 将混合液加入细胞培养盘混匀。37℃培养。

4. 4-6小时更换新的培养基。